7.如何檢測引物的純度,？
答：實驗室方便的作法是用page方法,。使用加有7m尿素的16%的聚---凝膠進(jìn)行電泳,。取0.2-0.5od的引物,，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，---怎么做,，上樣前加熱變性(95℃,，2mins)。加入尿素的目的一是變性,，二是增加樣品比重,，容易加樣。600v電壓進(jìn)行電泳,，一定時間后(約2-3小時),，剝膠，用熒光tlc板在紫外燈下檢測帶型,，在主帶之下沒有雜帶,，說明純度是好的。如果條件許可,，也可以用eb 染色或銀染方式染色,。
而有的廠家提供maldi-tof質(zhì)譜qc控制，從而保障了合成的準(zhǔn)確率：
bioneer使用多重maldi-tof質(zhì)譜儀進(jìn)行全自動裝載及監(jiān)測,。 每份樣品的質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)將自動插入到寡核苷酸的信息單中,。bioneer是上僅有的幾個對生產(chǎn)的每份核苷酸 (單個寡核苷酸和高通量和成) 都用maldi-tof質(zhì)譜儀檢測進(jìn)行核苷酸qc檢測的廠商，而且免費提供質(zhì)譜數(shù)據(jù),。
8.如何計算引物的濃度,？
答：引物保存在高濃度的狀況下比較穩(wěn)定。引物一般配制成10-50pmol/ul。 一般情況下,，建議將引物的濃度配制成50pmol/ul,，加水的體積微升按下列方式計算：v (微升)= od數(shù)*乘33 *乘*乘20000 / (除) 引物的分子量。引物的分子量可以從合成報告單上獲得,。如果需要配制成其他濃度,，按上述公式換算。
注意：1 od260= 33 ug/ml.
外顯子測序
外顯子組測序exome-seq是對定向富集的基因組dna進(jìn)行高通量測序,，它能夠以相對低的費用對人類外顯子組進(jìn)行拷問,。2009年，外顯子組捕獲工具的出現(xiàn),，實時熒光定量pcr,，讓外顯子組測序這種技術(shù)迅速紅起來。到目前為止,，已有超過1萬個外顯子組被測序,。
如今有多家公司推出了外顯子組捕獲試劑，包括羅氏nimblegen,、安捷倫,、illumina，還有現(xiàn)在的華大基因,。這些方法究竟孰優(yōu)孰劣,，斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)系的研究人員對市場上三個主流的外顯子組測序平臺進(jìn)行了比較。該研究結(jié)果發(fā)表在《nature biotechnology》上。研究人員利用安捷倫,、illumina和nimblegen的外顯子組測序平臺對同一個人類---樣品進(jìn)行分析,。他們的結(jié) 果表明，nimblegen平臺作為一個使用高密度重疊探針的平臺,，盡管覆蓋了較少的基因組區(qū)域,，但在靈敏檢測小的變異時所需的測序量也少。在同樣獲得80m測序數(shù)據(jù)的情況下,，nimblegen有97%的目標(biāo)序列達(dá)到10x以上的測序---,，而其他產(chǎn)品只有90%。而安捷倫和illumina的探針能夠在低密度下捕獲更多數(shù)量的變異,。此外,，illumina還捕獲了未翻譯的區(qū)域，這是nimblegen和安捷倫平臺無法靶定的,。研究人員還比較了同一樣品的外顯子組測序和全基因組測序wgs,，顯示外顯子組測序能夠檢測到wgs錯過的小變異。
除了文中提到了三個主流平臺,，外顯子組捕獲方面的新產(chǎn)品也在不斷推出,，研究人員的選擇也將更廣泛。羅氏nimblegen即將推出新一代的外顯子液相捕獲產(chǎn)品,。這一新產(chǎn)品將可捕獲64m的基因組序列,，包括外顯子以及mirna，它含與其他nimblegen液相捕獲產(chǎn)品相同的2.1m高密度探針,，以高xiao,、均一、特異,、的定向捕獲,。
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