分子實驗介紹——熒光定量pcr檢測
熒光定量pcr是檢測生物樣品中rna含量的普遍的方法，通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特---的探針，對pcr產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記---，pcr檢測，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程,，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。目前主要使用sybr green和taqman法對rna含量進(jìn)行檢測,。sybr green在低樣本量時成本較低，目前選用的較多,。
sybr green i是一種只與dna雙鏈結(jié)合的熒光染料,。當(dāng)它與dna雙鏈結(jié)合時，發(fā)出熒光,；從dna雙鏈上釋放出來時,，熒光信號急劇減弱,。因此，---,，在一個體系內(nèi),，其信號強度代表了雙鏈dna分子的數(shù)量。sybr green熒光染料-量pcr的基本過程是：1,、開始反應(yīng),，當(dāng)sybr green染料與dna雙鏈結(jié)合時發(fā)出熒光。2,、dna變性時,，sybr green染料釋放出來，熒光急劇減少,。3,、在聚合延伸過程中，引物退火并形成pcr產(chǎn)物,。4,、聚合完成后，sybr green染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合,，定量pcr系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大,。
實驗流程：細(xì)胞或組織rna提取-rna濃度檢測-rna逆轉(zhuǎn)錄-定量pcr檢測。
結(jié)果示例：
圖 a 基因擴增曲線圖,；b 基因擴增溶解曲線圖,；c mrna相對表達(dá)量變化
從圖中可以擴增曲線可以看出目的rna擴增效果，內(nèi)江pcr,，溶解曲線可以看出引物識別特---情況,，通過使用δδct方法計算可以得到每個組中目的mrna表達(dá)變化。
單細(xì)胞rna測序
單細(xì)胞rna測序也稱scrna-seq,。通常而言,，一般的組織細(xì)胞rna-seq實驗會產(chǎn)生1000萬個讀數(shù)，如果一個基因的頻率超過50rpkm,，即每百萬讀數(shù)中每千個堿基中超過50個,，這一基因即被認(rèn)為有表達(dá)。泊松分布下,，1kb長的基因有超過500個讀數(shù)和4%的小變異系數(shù),，即cv值；哺乳動物細(xì)胞通產(chǎn)含有200,，000個mrna,，因此至少要用50個單細(xì)胞一起才能到達(dá)小cv值；考慮到逆轉(zhuǎn)錄的效率和環(huán)境干擾等因素，為得到準(zhǔn)確的表達(dá)和細(xì)胞種類的識別,，需要使用的細(xì)胞數(shù)量實際要更多,。
rna提取
1.棄去培養(yǎng)液，用pbs清洗兩次1-2,。
2.棄去pbs,，用1000u1吸干凈殘余pbs。
3.加1ml trizol研磨b 41,。
4. 1.5miep管標(biāo)號與每孔相對應(yīng)備用,。
5.研磨好的溶液轉(zhuǎn)移至對應(yīng)的 ep管中國。
6.往每個ep管中加入250ul,，劇烈震蕩30s,，實時定量pcr， 冰上靜置12min[問l,。
7. 所有樣品4c離心,，轉(zhuǎn)速: 13500轉(zhuǎn)1分鐘，時間: 15min.
8. 再次標(biāo)記一批同樣編號ep管,。
9.離心后吸上清液400u1移入相應(yīng)編號的ep管中,，再加入400ul異充
分混勻。4c冰箱35min,。
10. 4c離心,，轉(zhuǎn)速: 13500轉(zhuǎn)1分鐘，時間: 10min.
11.棄去.上清液,，加1m175%---,，輕搖7]。
12. 4c離心,，10600轉(zhuǎn)/分鐘,，時間: 5min.
13. 棄上清液濾紙吸干。
14. 加depc水10ul溶解,，-80c保存,。進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄前測濃度。
組織rna提取
1,、剪米粒大小組織塊放入ep管中標(biāo)號,。
2、ep管中加300ul trizol浸泡30分鐘或更久,。
3,、用研磨棒研磨，以肉眼很難看到組織為宜,。
4,、加700u1 trizol靜 置5分鐘。
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