二、大腸菌群檢驗方法:
由于大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的-,，即:需氧及兼性厭氧,、在37°c能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞。因此大腸菌群的檢測一般都是按照它的定義進(jìn)行,。 目前國內(nèi)采用的進(jìn)出口食品大腸菌群檢測方法主要有和原商檢局制訂的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),。兩個標(biāo)準(zhǔn)方法在檢測程序上略有不同,。
(一):采用三步法,，即:乳糖發(fā)酵試驗、分離培養(yǎng)和證實試驗,。乳糖發(fā)酵試驗:樣品稀釋后,，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管,。36士1c培養(yǎng)48土2h,，觀察是否產(chǎn)氣。分離培養(yǎng):將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上,，36士1°c培養(yǎng)18-24h,，觀察菌落形態(tài)。證實試驗:挑取平板上的菌落，進(jìn)行革蘭氏染色觀察,。同時接種乳糖發(fā)酵管36士1°c培養(yǎng)24土2h,，觀察產(chǎn)氣情況。
報告:
根據(jù)證實為大腸陽性的管數(shù),，查mpn表,，報告每100ml ( g)大腸菌群的mpn值。具體操作參見gb4789. 3-94 《--食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗大腸菌群測定》
(二)原商檢局制訂的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),，等效采用美國fda的標(biāo)準(zhǔn)方法,，用于對出口食品中的大腸進(jìn)行檢測。本方法采用兩步法：推測試驗:樣品稀釋后,，實時熒光定量pcr,，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管lst肉湯,。36士1c培養(yǎng)48士2h,，觀察是否產(chǎn)氣。證實試驗:將產(chǎn)氣管培養(yǎng)物接種煌綠乳糖膽鹽(bglb)肉湯管中,，36士1°c培養(yǎng)48士2h,，觀察是否產(chǎn)氣。以bglb產(chǎn)氣為陽性,。查mpn表,，-怎么做，報告每ml(g)樣品中大腸菌群的mpn值,。具體操作參見sn0169-92《--進(jìn)出口商品檢驗行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 出口食品中大腸菌群,、糞大腸菌群和大腸檢驗方法》
22.同樣的od用page檢測，eb染色為什么深淺不一,？
答：通�,？梢杂胑b染色的方法來判斷雙鏈dna的量(如質(zhì)粒dna)，因為eb可以嵌合到雙鏈dna中,。而合成的單鏈dna,，西藏pcr，由于堿基組成不同,，形成二級結(jié)構(gòu)的可能性不同,，eb的染色程度也會有差異，比如oligo(dt)等不形成二級結(jié)構(gòu),，eb染色效果就非常差,。所以不要用eb染色的方法來定量，而用紫外分光光度計檢測,。同樣道理,，用eb染色來照片不適合所有引物,。
23.引物不純會有什么后果？
答：引物不純可能會導(dǎo)致：1)非特-擴(kuò)增,；2)無法用預(yù)先設(shè)計在引物5′端酶切位點的酶切開,，-是沒有保護(hù)堿基的引物；3) 用于測序出現(xiàn)雙峰或亂峰,。解決辦法重新合成或重新純化,。
24.已經(jīng)溶解的引物，為什么原先使用正常,，而過一段時間再使用就不好了,？
答：如果溶解引物的水ph過低或污染了菌或-酶，會使引物降解,。使用時沒有充分解凍混合,，-，液體不均勻也可能會造成引物加入量不準(zhǔn)確,。建議分裝引物,，避免反復(fù)凍溶。建議使用10mmt ris ph7.5緩沖液溶解引物,，因為有些蒸餾水的ph值比較低ph4-5,， 引物在這種條件下不穩(wěn)定。還有一種可能性是引物沒有問題,，而是pcr使用材料-是模板的與先前使用的不完全一致,。
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