流式細(xì)胞分選

流式細(xì)胞分選技術(shù)是利用流式細(xì)胞分選儀，以高能量激光照射高速流動(dòng)狀態(tài)下被熒光色素染色的單細(xì)胞或微粒,，測(cè)量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強(qiáng)度,，從而對(duì)細(xì)胞(或微粒)的物理、生理,、生化,、免yi、遺傳,、分子生物學(xué)性狀及功能狀態(tài)等進(jìn)行定性或定量檢測(cè)的--種現(xiàn)代細(xì)胞分析技術(shù),，它可根據(jù)發(fā)射光的熒光強(qiáng)度和波長(zhǎng)將發(fā)光顆粒亞群分開并可實(shí)現(xiàn)單ke隆分選，能復(fù)雜樣本中的細(xì)胞進(jìn)行鑒定,、分類,、定量和分離,，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，單次可同時(shí)對(duì)其中一種到四種特定細(xì)胞進(jìn)行速分選純化,、高通量單分選或細(xì)胞芯片制備,。分選后的細(xì)胞能直接用于培養(yǎng)、移植,、---提取,、單細(xì)胞pcr擴(kuò)增或原位雜交等，可進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞基因,、蛋白,、功能水平的研究和不同細(xì)胞之間的差異化研究。硬件中樣本細(xì)胞丟棄的比例低于5%,，---樣本中目標(biāo)細(xì)胞的高回收率,。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)介紹——慢---建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系

慢---包裝：公司使用3質(zhì)粒慢---包裝系統(tǒng)，慢---系統(tǒng)使用plko.1-egfp,、pspax2,、pmd2.g，過表達(dá)慢---系統(tǒng)使用plvx-acgfp,、pspax2,、pmd2.g三質(zhì)粒系統(tǒng)，將質(zhì)�,；靹蚝笫褂昧姿徕}轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染至hek293t細(xì)胞中,，培養(yǎng)48h后，收集上清,。使用genecopo公司慢---顆粒純化試劑盒將慢---純化,。純化后留取部分檢測(cè)---滴度，其余---凍存于-80℃冰箱中,。

滴度檢測(cè)：將---顆粒使用梯度稀釋,，分別293t細(xì)胞，72h后,，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況,。根據(jù)細(xì)胞熒光量計(jì)算---滴度。

細(xì)胞：在---前---對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),，感受態(tài)細(xì)胞,，接種約10000個(gè)細(xì)胞于12孔板中，培養(yǎng)過夜后使用無培養(yǎng)基稀釋---,，加入12孔板中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行,，---數(shù)量根據(jù)細(xì)胞的moi加入若無moi，需做---梯度：1,，5,，10,，50，100 5個(gè)梯度對(duì)細(xì)胞,，6h后去除含---溶液,，加入完全培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后,，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度,。同時(shí)加入puromycin對(duì)細(xì)胞篩選，篩選約2周時(shí)間,。細(xì)胞篩選好后,，使用定量pcr和western blot檢測(cè)目的基因的穩(wěn)定表達(dá)情況。

實(shí)驗(yàn)流程：慢---質(zhì)粒構(gòu)建-hek293t細(xì)胞培養(yǎng)-質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞----收集----純化----滴度檢測(cè)-細(xì)胞-穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞篩選-穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞鑒定

結(jié)果示例：

                                               圖 a ---滴度檢測(cè),；b 目的細(xì)胞---效果圖