分子與質(zhì)粒載體構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)原理

外源dna與載體分子的連接就是dna重組,，---怎么做,，這樣重新組合的dna叫做重組體或重組子。重組的dna分子是在dna連接酶的作用下,，pcr實(shí)驗(yàn)室,，有mg2+、atp存在的連接緩沖系統(tǒng)中,，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源dna分子進(jìn)行連接,。dna連接酶有兩種：t4噬菌體dna連接酶和大腸dna連接酶。兩種dna連接酶都有將兩個(gè)帶有相同粘性末端的dna分子連在一起的功能,，而且t4噬菌體dna連接酶還有—種大腸連接酶沒有的特性,，即能使兩個(gè)平末端的雙鏈dna分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低,，一般可通過提高t4噬菌體dna連接酶濃度或增加dna濃度來提高平末端的連接效率,。

t4噬菌體dna連接酶催化dna連接反應(yīng)分為3步：，t4dna連接酶與輔助因子atp形成酶—amp復(fù)合物,；然后,，酶—amp復(fù)合物再結(jié)合到具有5磷酸基和3---切口的dna上，使dna腺苷化,；后產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵,，把切口封起來。

dna重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法,，為了防止載體本身的自連,，可以通過(牛堿性磷酸酶)cip處理克服。

連接反應(yīng)的溫度在37℃時(shí)有利于連接酶的活性.但是在這個(gè)溫度下,，粘性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的,。因此人們找到了一個(gè)折中溫度,，即12-16℃，連接12-16h(過夜),，這樣既可大限度地發(fā)揮連接酶的活性,，又---到短暫配對(duì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

lncrna測序

長鏈非編碼rnaslong non-coding rnas,，lncrnas一般是指長度大于200 nt的rna,，位于細(xì)胞核內(nèi)或胞漿中，不參與蛋白質(zhì)編碼功能,，以rna形式在多種層面上表觀遺傳調(diào)控,、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等調(diào)控基因的表達(dá)水平，西藏pcr,，在生命活動(dòng)中具有重要作用,。

長鏈非編碼rna測序long non-coding rna sequencing，lncrna-seq是一種使用特定方法降低樣本中rrna 的豐度,，對(duì)富集到的 rna進(jìn)行---構(gòu)建,，再對(duì)高通量測序儀產(chǎn)出的數(shù)據(jù)進(jìn)行信息分析的研究方法。lncrna-seq可---獲得樣本中全部的lncrnas信息,，對(duì)lncrnas的類別,、功能進(jìn)行的深入分析，從而快速準(zhǔn)確地獲得與特定生物學(xué)過程例如發(fā)育,、---等相關(guān) lncrna信息,。