3、參數(shù)設(shè)置
使用488nm激發(fā)波長,，525nm發(fā)射波長，實時或逐時間點檢測-前后熒光的強弱,。dcf的熒光光譜和fitc非常相似，可以用fitc的參數(shù)設(shè)置檢測dcf,。dcf的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考下圖,。
4、其它說明
陽性對照可以按照1：1000的比例使用,。例如裝載好探針的細(xì)胞共1毫升,，可以加入1微升的陽性對照-。通常-后20-30分鐘內(nèi)可以觀察到非常-的活性氧水平升高,。對于不同的細(xì)胞,，活性氧陽性對照的效果可能有較大的差別。如果在-后30分鐘內(nèi)觀察不到活性氧的升高,，宜賓pcr,，可以適當(dāng)提高活性氧陽性對照的濃度。如果活性氧升高得過快,，可以適當(dāng)降低活性氧陽性對照的濃度,。
另外，對于某些細(xì)胞,，如果發(fā)現(xiàn)沒有-的陰性對照細(xì)胞熒光也比較強,，可以按照1：2000-1：5000稀釋dcfh-da，使裝載探針時dcfh-da的濃度為2-5微摩爾/升,。探針裝載的時間也可以根據(jù)情況在15-60分鐘內(nèi)適當(dāng)進行調(diào)整,。
腺-包裝原理介紹
腺-是一種沒有包膜的直徑為79-90nm的顆粒，由252個 殼粒呈二十面體排列構(gòu)成,。每個殼粒的直徑為7-9nm,。衣殼里是線狀雙鏈dna分子，兩端各有長約100bp的反向重復(fù)序列,。人體腺- 已知有33種,，分別命名為ad1-ad33，-怎么做,，研究詳細(xì)得是ad2.
腺-是一種無包膜的球型結(jié)構(gòu)的-,，實時定量pcr，遺傳物質(zhì)為線型 雙股dna形式,。腺-的特點：1gan染范圍廣對人致病性低,；2對增殖和非增殖細(xì)胞均具有g(shù)an染性；3能有效進行增殖； 4-滴度高,；5不整合到染色體中,，無插入致突變性；(6)外源基因裝載容量大,。由于腺-的這些特點使其廣泛地應(yīng)用于體 外基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、體內(nèi)接種yi苗,、和基因zhi療等各個領(lǐng)域,。
實驗方法
1.獲得目的基因序列；
2.構(gòu)建-表達(dá)載體質(zhì)粒,；
3.表達(dá)載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒重組,；
4.gan染hek293，包裝出-,；
5.-擴增,、濃縮；
6.滴度測定,。
20.primer設(shè)計的基本原則是什么,？
答：引物設(shè)計的下列原則供您參考。
◆引物長度一般在18-35mer,。
◆g-c含量控制在40-60%左右,。
◆避免近3端有酶切位點或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
◆如果可能避免在3端5個堿基有2個以上的g或c,。
◆如果可能避免在3端1個堿基為a,。
◆避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，-是要避免gggg或更多g出現(xiàn),。
◆退火溫度tm控制在 58-60c 左右,。
◆如果是設(shè)計點突變引物，突變點應(yīng)盡可能在引物的中間,。
21.為什么引物的od260/od280小于1.5 ,？
答：引物應(yīng)該全是dna，但是od260/od280的比值為什么那么低,，pcr實驗室,，怎么會有蛋白質(zhì)污染？引物化學(xué)合成,，哪里有機會污染到蛋白質(zhì),？需要-的是od260/od280的比值不能用來衡量引物的純度。od260/od280的比值過低一般是由于引物中c/t 的含量比較高所致,。下表是一個20mer 同聚體引物的od260/od280的比值,，清楚表明od260/od280的比值與引物的堿基組成密切相關(guān)。
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