蛋白提取

大部分蛋白質(zhì)都可溶于水,、稀鹽,、稀酸或堿溶液,， 少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于-,、-等有ji溶劑中,，因些，-,，可 采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶,。

(一)水溶液提取法

稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好,、溶解度大,、是提取蛋白質(zhì)常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍,，提取時(shí)需要均勻的攪拌,，以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而定,。一方面,，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大,，因此，溫度-于溶 解,，縮短提取時(shí)間,。但另一方面. ，溫度升高會(huì)使蛋白質(zhì)變性失活,，因此,，基于這一點(diǎn)考慮提取蛋白質(zhì)和酶時(shí)一般采用低溫( 5度以下)操作。為了避免蛋白質(zhì)提以過程中的降解,，pcr實(shí)驗(yàn)室,，可加入蛋白 水解酶抑zhi劑(如二yi--，碘yi酸等),。

3,、參數(shù)設(shè)置

使用488nm激發(fā)波長(zhǎng)，525nm發(fā)射波長(zhǎng),，實(shí)時(shí)或逐時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)-前后熒光的強(qiáng)弱,。dcf的熒光光譜和fitc非常相似，可以用fitc的參數(shù)設(shè)置檢測(cè)dcf,。dcf的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考下圖,。

4、其它說明

陽性對(duì)照可以按照1：1000的比例使用,。例如裝載好探針的細(xì)胞共1毫升,，可以加入1微升的陽性對(duì)照-。通常-后20-30分鐘內(nèi)可以觀察到非常-的活性氧水平升高,。對(duì)于不同的細(xì)胞,，活性氧陽性對(duì)照的效果可能有較大的差別。如果在-后30分鐘內(nèi)觀察不到活性氧的升高,，可以適當(dāng)提高活性氧陽性對(duì)照的濃度,。如果活性氧升高得過快，可以適當(dāng)降低活性氧陽性對(duì)照的濃度,。

另外,，對(duì)于某些細(xì)胞，如果發(fā)現(xiàn)沒有-的陰性對(duì)照細(xì)胞熒光也比較強(qiáng),，可以按照1：2000-1：5000稀釋dcfh-da,，使裝載探針時(shí)dcfh-da的濃度為2-5微摩爾/升。探針裝載的時(shí)間也可以根據(jù)情況在15-60分鐘內(nèi)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整,。