三、自噬過程進行觀察和檢測

1、觀察自噬體的形成

由于自噬體屬于亞細胞結(jié)構(gòu),，普通光鏡下看不到,，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下,。phagophore的特征為:新月狀或杯狀,，雙層或多層膜，單細胞測序技術(shù),，有包繞胞漿成分的趨勢,。自噬體(av1 )的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含胞漿成分,，如線粒體,、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等,。自噬溶酶體(av2 )的特征為:單層膜,，胞漿成分己降解。( autophagic vacuolo av )

2,、在熒光顯微鏡下采用gfp-lc3融合蛋 白來示蹤自噬形成由于電鏡耗時長,，不利于監(jiān)測(monitoring) 自噬形成，人們利用lc3在自噬形成過程中發(fā)生---的現(xiàn)象開發(fā)出了此技術(shù),。無自噬時,，gfp-lc3融合蛋 白彌散在胞漿中;自噬形成時，gfp-lc3融合蛋白轉(zhuǎn) 位至自噬體膜,，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點,，一個斑點相當于一個自噬體，可以通過計數(shù)來評價自噬活性的高低,。

3,、利用western blot檢測lc3-ii/比值的變化以評價自噬形成自噬形成時，胞漿型lc3 (即 lc3-i)會酶解掉一小段多肽,，轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型(即lc3-id,，因此，lc3-ii/比值 的大小可估計自噬水平的高低,。(注意: lc3對lc3-ii有更高的親和力,，細胞培養(yǎng)，會造成假陽性,。方法2和3需結(jié)合使用,，同時需考慮溶酶體活性的影響。)

4,、mdc (monodansylcadaverine ,，單丹---尸胺)染色:包括自噬體,，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特---的,。

5,、celltrackertm green染色:主要用于雙染色，流式細胞檢測,，但其能染所有的液泡,，故也屬于非特---的。