大鼠gu髓間充質gan細胞的分離

操作方法

(1 )取sd大鼠( 2周齡)，頸椎脫臼法處死后立即用75%---浸泡,，移入超凈工作臺內(nèi),，用大頭針固定大鼠四肢于工作臺面的泡沫板上。

(2)碘酒擦拭四肢,，再用酒精棉球擦拭,，無菌條件下用滅菌消毒后的鑷子和剪刀分離出大鼠股骨和脛骨，剔除骨頭表面肌肉,， pbs溶液沖洗兩遍,。

(3 )從中間剪斷股骨和脛骨，用2ml無菌注she器吸取dmem/f 12溶液沖出gu髓細胞多次,，再用針頭吹打,，吸管吸入離心管內(nèi)，1000r/min離心5min,，棄上清,，甘肅細胞，用pbs重懸細胞,。

(4 )緩慢將細胞懸液加入預先裝有5ml淋巴細胞分離液的15ml離心管內(nèi),，保持細胞懸液在淋巴細胞分離液上層，注意不要攪動液面,，保持二者分層界面,。

(5 ) 2000rpm離心15-25min，離心后溶液分4層,，吸取中間骨sui基質細胞層(白色渾濁狀),， pbs洗三次。

(6)用含15%胎牛xue清及青鏈mei素的dmem/f 12以106/ml的細胞濃度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中,， 置37°c,、5%co2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

( 7 ) 24小時后棄去培養(yǎng)液(看細胞貼壁情況),，pbs沖洗2-3次去除末貼壁細胞,，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。以后每3d半量換液1次,，-般10d細胞生長融合,。

(8 )經(jīng)0.25%胰酶---，1 : 2傳代,，其后一般3-5d傳代1次,，選取生長-的第三代細胞進行后續(xù)實驗。

軟gu細胞培養(yǎng)

(1)---脫頸處死，備皮,，用75%酒精消毒背部及四肢皮膚,。

(2)無菌操作下取下雙側股骨頭及膝關節(jié)(保留周圍肌肉，軟gu不能暴露),，75%酒精浸泡5分鐘,，轉移至pbs緩沖液中，帶入超凈工作臺,，細胞毒性實驗,，剔除關節(jié)周圍附著的軟組織，打開髖,、膝關節(jié),，細胞生物學實驗，用尖刀削取關節(jié)軟gu組織,，---,，置入裝有pbs緩沖液的無菌培養(yǎng)皿，防止軟gu組織被風干,。

(3)pbs緩沖液充分漂洗軟gu小塊3次,，然后用小剪刀將軟gu塊切碎至約imm3大小。

(4)再次用pbs緩沖液沖洗3次,，濾干,，將細小的軟gu塊置入放有0.2%的ii型膠原酶3ml的廣口瓶里，搖勻后置于37°c恒溫震蕩箱中---,，40分鐘后將上層---液轉移至15ml規(guī)格離心管中,，800r/min離心5min，收集細胞(沉淀物),，加入含10%的胎牛xue清dmem培養(yǎng)液4ml并吹打混勻,，制成軟gu細胞混懸液。

(5)把---所得的軟gu細胞混懸液收集于離心管中,，經(jīng)濾網(wǎng)過濾后用細胞計數(shù)板計數(shù),，并把細胞混懸液密度調(diào)整為2x105/ml接種于25cm2規(guī)格的培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶放置于co2培養(yǎng)箱內(nèi),。培養(yǎng)條件為37°c,、5%co2。

(6)未---完的軟gu小塊繼續(xù)用ii型膠原酶如_上法---,，直至軟gu塊基本消失,。

(7)每日在倒置顯微鏡下觀察軟gu細胞生長情況并拍照保存。