細胞elispot檢測
1．培養(yǎng)板的預處理：在24孔培養(yǎng)板內(nèi)加0.5ml 0.2%戊er醛,，37℃,，4h,，棄掉板中的處理液，用pbs洗滌3次,，每次3min,；
2．抗原包被：將適量抗原溶于包被緩沖液中，每孔加入0.5ml,，4℃過夜,，pbs-t洗滌3次,，每次3min；
3．制備細胞懸液：將待測已致敏小鼠處死,，取出pi臟,，置于加有hanks液的平皿內(nèi)，用鈍頭直角9號zhu射器針頭破少許脾被膜后,，趕出細胞,，用毛細吸管輕輕吹散細胞團后，將懸液通過250目尼龍網(wǎng),，取濾液,，1000r/min離心5min，hanks液洗滌3次,，計數(shù)細胞后,，---實驗，用1640液重新懸浮細胞,，配成所需濃度,；
4．往各孔中加入0.5ml含不同濃度104-106/ml的細胞懸液，置37℃,，5％co2條件下孵育2-4h,，棄掉培養(yǎng)液，細胞實驗,，pbs-t洗滌3次，細胞融合實驗報告,，每次3min,；
5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗tibio-ab2μg/ml，37℃孵育1h或4℃過夜,，棄掉液體,，pbs-t洗滌3次，每次3min,；
6．加入辣根---化物酶結(jié)合的親合素avi-hrp2μg/ml,，37℃孵育30min，棄掉液體,，pbs-t洗滌3次,，每次3min；
7．配制明膠-底物液：在37℃水浴中,，將2.5mltmb溶液4mg/ml jia醇溶液滴加入7.5ml10%明膠溶液用ph5.0磷酸鈉-檸檬酸緩沖液配制邊加邊攪,，溶液呈白色，加入14μl 3% h202,；
8．顯色與計數(shù)：將培養(yǎng)板底冰浴,，每孔加入0.6ml明膠-底物液,，約3min，混合液凝固,，將培養(yǎng)板取出,，置室溫5min，將板倒置,，用肉眼和低倍放大鏡計數(shù)所顯示出的顏色的斑點,。
mtt檢測
mtt 是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活xi胞線粒體中的---脫氫酶能使外源性 mtt 還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚formazan并沉積在細胞中,，而---無此功能,。二jia基---dmso能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免yi檢測儀在 570nm 波長處測定其光吸收值,，可間接反映活xi胞數(shù)量,。
大鼠shen小球內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)
2.原代細胞培養(yǎng):(1)shen臟原位灌洗:sd大鼠用25%烏拉坦腹整注-zui后仰臥固定。胸腹部消森并分離胸主動脈,，以無菌的冷hank液漱朱洗血.同時剪破shen靜脈利于液體流出,。1-2min后shen臟色澤變白，湖北細胞,，取出雙shen冰浴保存,。
(2)shen小球分離:參照green等方法改進。將灌洗后的shen臟撕下shen被膜.去除髓質(zhì)后將皮質(zhì)剪成約1-2mm的碎塊,，輕碾shen皮質(zhì)依次通過80.120和200目鋼篩,。收集shen小球。
(3)shen小球---和培養(yǎng),；將提取的shen小球加人0.1% in 型膠原酶---后收集沉淀,。以2x10* 的shen小球數(shù)接種于鋪有1%明膠培養(yǎng)瓶內(nèi)，加a配制好的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液(mfm.hepes 20 mmnovl 20%胎牛xue清0. 66 u---/ml.血管內(nèi)皮生長因子20 ng /ml,、---鈉100 u/ml.青莓su100 u/ml,、鏈霉su100 μ/ml) .靜止培養(yǎng)3 d后逐日觀察shen小球的貼壁情況。待shen小球充分貼壁后常規(guī)換液.第3同進行純化,。
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