三,、自噬過程進行觀察和檢測

1,、觀察自噬體的形成

由于自噬體屬于亞細胞結構,，普通光鏡下看不到,，因此,，直接觀察自噬體需在透射電鏡下,。phagophore的特征為:新月狀或杯狀,，雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢,。自噬體(av1 )的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結構,，內含胞漿成分，如線粒體,、內質網(wǎng)、核糖體等,。自噬溶酶體(av2 )的特征為:單層膜,，胞漿成分己降解。( autophagic vacuolo av )

2、在熒光顯微鏡下采用gfp-lc3融合蛋 白來示蹤自噬形成由于電鏡耗時長,，不利于監(jiān)測(monitoring) 自噬形成,，人們利用lc3在自噬形成過程中發(fā)生---的現(xiàn)象開發(fā)出了此技術。無自噬時,，gfp-lc3融合蛋 白彌散在胞漿中;自噬形成時,，gfp-lc3融合蛋白轉 位至自噬體膜，細胞系,，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點,，一個斑點相當于一個自噬體，---,，可以通過計數(shù)來評價自噬活性的高低,。

3、利用western blot檢測lc3-ii/比值的變化以評價自噬形成自噬形成時,，胞漿型lc3 (即 lc3-i)會酶解掉一小段多肽,，轉變?yōu)?自噬體)膜型(即lc3-id，因此,，lc3-ii/比值 的大小可估計自噬水平的高低,。(注意: lc3對lc3-ii有更高的親和力，會造成假陽性,。方法2和3需結合使用,，同時需考慮溶酶體活性的影響。)

4,、mdc (monodansylcadaverine ,，單丹---尸胺)染色:包括自噬體，所有酸性液泡都被染色,，故屬于非特---的,。

5、celltrackertm green染色:主要用于雙染色,，但其能染所有的液泡,，故也屬于非特---的。