聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)

操作步驟

1.在冰浴中,，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。

1qpcr buffer

5 μl

dntp mix( 2mm )

4 μl

引物1(10pm)

μl 2

引物2 ( 10pm)

2μl

taq酶(2u/ul)

1 μl

dna模板( 50ng-1μg/μl )

1 μl

加ddh2o至

μl 50

視pcr儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油,。

2.調(diào)整好反應(yīng)程序,。將上述混合液稍加離心，pcr檢測(cè),，立即置pcr儀上執(zhí)行擴(kuò)增,。-般:在93°c

預(yù)變性3-5min ，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段: 93°c 40s***58°c 30s***72°c 60s ,，循環(huán)30-35

次,，后在72°c保溫7min。

3.結(jié)束反應(yīng),， pcr產(chǎn)物放置于4°c待電泳檢測(cè)或-20°c長(zhǎng)期保存,。

4. pcr的電泳檢測(cè):如在反應(yīng)管中加有石蠟油，實(shí)時(shí)熒光定量pcr,，需用100ul進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,，以

除去石蠟油;否則，直接取5- 10μl電泳檢測(cè),。

單細(xì)胞測(cè)序英語(yǔ)：single cell sequencing采取優(yōu)化的下一代dna測(cè)序技術(shù)ngs檢測(cè)單細(xì)胞的序列,，可以獲得特定微環(huán)境下的細(xì)胞序列差異以方便研究其功能差異等。對(duì)個(gè)體細(xì)胞的dna測(cè)序可以幫助我們了解例如在中的小范圍細(xì)胞的變異,；對(duì)其進(jìn)行rna測(cè)序可以幫助我們了解和鑒別不同的細(xì)胞類(lèi)型與其表現(xiàn)的基因,，對(duì)研究發(fā)育生物學(xué)等有較大裨益。

分離單細(xì)胞

在全基因組擴(kuò)增和測(cè)序前,，有很多方法可以分離細(xì)胞個(gè)體,，其中流式細(xì)胞術(shù)facs較為常用。個(gè)體細(xì)胞可以用顯微操作來(lái)收集,，這樣較為快捷而且成本較低,，但是比較有技術(shù)難度，而且顯微鏡下對(duì)細(xì)胞的錯(cuò)誤分類(lèi)容易影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。激光捕獲顯微切割技術(shù)lcm亦可以用來(lái)收集單細(xì)胞,。但是盡管激光捕獲顯微切割可以保留樣本細(xì)胞在組織中的空間位置，但是捕獲單細(xì)胞的時(shí)候容易連帶周?chē)��?xì)胞的物質(zhì),。高通量的細(xì)胞個(gè)體分離還可以使用微流控技術(shù),。微流控技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)都能準(zhǔn)確而自動(dòng)地分離無(wú)偏樣本。但是,，兩種方法都要求首先將細(xì)胞從其為環(huán)境中脫離,，因此可能在rna表達(dá)分析中造成對(duì)轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)的干擾。