細(xì)胞實(shí)驗(yàn)介紹——流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡
流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期：
細(xì)胞周期：指細(xì)胞從---次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動(dòng)過程,，通常由g0/g1期、s期,、g2期和m期組成,。g0/g1期：有絲分裂發(fā)生，細(xì)胞分裂成兩個(gè)細(xì)胞,，進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期,，或者進(jìn)入靜止期g0期，而g0期從dna含量上無法與g1期區(qū)分,，細(xì)胞開始rna和蛋白質(zhì)的合成,，但dna含量仍保持二倍體。s期：dna開始合成,，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn),，細(xì)胞核內(nèi)dna的含量介于g1期和g2期之間。g2期和m期：當(dāng)dna成為4倍體時(shí),，細(xì)胞進(jìn)入g2期,。g2期細(xì)胞繼續(xù)合成rna及蛋白質(zhì)，直到進(jìn)入m期,。
pi法是---的周期檢測(cè)方法,。pi為插入性-熒光染料，細(xì)胞生物學(xué),，能選擇性的嵌入-dna和rna雙鏈螺旋的堿基之間與之結(jié)合,，其結(jié)合的量與dna的含量成正比例關(guān)系，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析,，就可以得到細(xì)胞周期各個(gè)階段的dna分布狀態(tài),，從而計(jì)算出各個(gè)期的百分含量。
一般流程：細(xì)胞收集-70%酒精固定過夜-pi染色-流式細(xì)胞儀檢測(cè),。
細(xì)胞凋亡：細(xì)胞凋亡的早期就有細(xì)胞膜表面破損發(fā)生,。破損時(shí)凋亡細(xì)胞表面的磷脂腺絲氨酸(ps)可以從細(xì)胞內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)至細(xì)胞的外膜。該過程發(fā)生在之前,，檢測(cè)ps的表達(dá),，能反映早期凋亡。annexinv是ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白,，對(duì)ps有---的親和性,，并且可以與暴露于細(xì)胞外的ps相結(jié)合。利用這一原理,，可以將annexinv標(biāo)記熒光來識(shí)別早期的細(xì)胞凋亡,。通常利用annexinv-fitc和碘化丙啶(pi)來區(qū)分凋亡和壞---。pi的膜通透性很差，因而只能標(biāo)記壞死的細(xì)胞,。
一般流程：細(xì)胞收集-pi-annexinv標(biāo)記-流式細(xì)胞儀檢測(cè),。
結(jié)果示例：
圖 a 細(xì)胞周期檢測(cè)圖；b 細(xì)胞凋亡檢測(cè)圖
2,、快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟如下 [方法二]：
(1) 以 5×105 細(xì)胞/孔接種 6 孔板 (或 35 mm 培養(yǎng)皿) 培養(yǎng) 24 小時(shí),，使其達(dá)到 50～60% 板底面積。
(2) 在試管中配制 dna/脂質(zhì)體復(fù)合物方法如下：
在 1 ml 無 dmem 中稀釋 psv2-neo 質(zhì)粒 dna 或供體 dna,。
旋轉(zhuǎn) 1 秒鐘,，再加入脂質(zhì)體懸液，湖北細(xì)胞,，旋轉(zhuǎn),。
室溫下放置 5～10 分鐘，使 dna 結(jié)合在脂質(zhì)體上,。
(3) 棄去細(xì)胞中的舊液,，用 1 ml 無 dmem 洗細(xì)胞一次后棄去，向每孔中直接加入 1 ml dna/脂質(zhì)體復(fù)合物,，37℃ 培養(yǎng) 3～5 小時(shí),。
(4) 再于每孔中加入 20%fcs 的 dmem，繼續(xù)培養(yǎng) 14～24 小時(shí),，
(5) 吸出 dmem/dna/脂質(zhì)體混合物加入新鮮 10%fcs 的 dmem,，流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，2 ml/孔,，再培養(yǎng) 24～48 小時(shí),。
(6) 用細(xì)胞刮或---法收集細(xì)胞，以備分析鑒定,。
3,、穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法如下：
(1) 接種細(xì)胞同前，細(xì)胞長(zhǎng)至 50% 板底面積可用于轉(zhuǎn)染,。
(2)dna/脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞同前 (2),、(3) 步驟。
(3) 在每孔中加入 1 ml,、20%fcs 的 dmem，37℃ 培養(yǎng) 48 小時(shí),。
(4) 吸出 dmem,，用 g418 選擇培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，使細(xì)胞生長(zhǎng)一定時(shí)間,，篩選轉(zhuǎn)染,，方法參照細(xì)胞篩選法進(jìn)行。
小鼠精原gan細(xì)胞分離富集和培養(yǎng)
成年小鼠gao丸中約有108個(gè)細(xì)胞,，其中約有 2×104個(gè)是精原gan細(xì)胞,，僅占gao丸生精上皮細(xì)胞總數(shù)的 0.02～0.03%,，精原gan細(xì)胞數(shù)量太少不利于體外培養(yǎng).分離和富集精原gan細(xì)胞成為精原gan細(xì)胞體外培養(yǎng)能否成功的前提條件.尋找分離和富集小鼠精原gan細(xì)胞有效方法. 方法:出生6-8天小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，先用0.25%胰酶1mm edta---gao丸10min,，用胎牛xue清終止---,，用一次40-um孔徑的濾器過慮制成單 細(xì)胞懸液，30%percoll不連續(xù)密度梯度法離心富集精原gan細(xì)胞,，再根椐未分化精原gan細(xì)胞表面thy1.2(cd90.2)陽(yáng)性cd117(c- kit)陰性特點(diǎn)用流式細(xì)胞儀將精原gan細(xì)胞分選出來,，并在體外進(jìn)行培養(yǎng)嘗試. 結(jié)果:30%percoll密度梯度離心前cd117(c-kit)陽(yáng)性細(xì)胞占13.80±3.34%，cd90.2陽(yáng)性細(xì)胞占28.98±4.51%,， 二者都陽(yáng)性細(xì)胞占8.98±2.98%,，cd117陰性cd90.2陽(yáng)性細(xì)胞占18.36±2.67%;離心后 cd117(c-kit)陽(yáng)性細(xì)胞占12.37±3.34%，cd90.2陽(yáng)性細(xì)胞占56.98±4.51%,，二者都陽(yáng)性細(xì)胞占 8.20±3.98%,，cd117陰性cd90.2陽(yáng)性細(xì)胞占32.36±3.67%;cd117(c-kit)陽(yáng)性細(xì)胞和二者都陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比前后 比較差異無---性(p>;0.1)，cd90.2陽(yáng)性細(xì)胞和cd117陰性和cd90.2陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比前后比較差異有---性 (p<0.05);采用cd117和cd90.2作為標(biāo)志分子,，percoll離心后細(xì)胞懸液經(jīng)facs分選后獲得細(xì)胞純度
|
登錄后臺(tái)
滇公網(wǎng)安備 53011202000392