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擴增曲線
在real-qpcr中,對整個pcr反應擴增過程進行了實時的檢測并記錄其熒光信號,,隨著反應的進行,,監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線,即為擴增曲線,。熒光擴增曲線一般分為基線期,、指數(shù)增長期和平臺期。
在real-timeqpcr擴增早期,,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,,無法判斷產(chǎn)物量的變化,此時即為基線期,。
pcr反應過程中產(chǎn)生的dna拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,,隨著反應循環(huán)數(shù)的增加,,終pcr反應不再以指數(shù)形式生成模板,,從而進入“平臺期”。在該時期,,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,,pcr的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線---,所以根據(jù)終的pcr產(chǎn)物量不能計算出初始模板量,。
熒光染料的優(yōu)點:
產(chǎn)品僅用于科研使用簡便,;
可以與任何pcr產(chǎn)物結(jié)合;
價格便宜,;
熒光染料的缺點:
不能區(qū)分不同的雙鏈dna
引物二聚體會影響檢測的敏感性
非特---產(chǎn)物會影響結(jié)果的敏感性
引物二聚體和非特---擴增問題可以通過熔解曲線(meltingcurve)進行識別,,進而通過pcr引物的設計和反應條件的優(yōu)化得以解決�,?偟膩碚f,,sybrgreeni方法是一種基礎也的real-timeqpcr實驗手段。
更多:pcr-熒光探針法
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